摘要:为明确提取方法对清香木果实精油成分及抑菌和抗氧化活性的影响,采用超声辅助水蒸气蒸馏法(USD)和微波辅助水蒸气蒸馏法(MSD)提取精油,通过固相微萃取(SPME)和气相色谱 - 质谱联用(GC-MS)技术测定精油的化学成分,采用滤纸片法和自由基清除法检测抑菌和抗氧化活性。结果表明:两种精油的主要成分均为 (+)-α- 蒎烯,USD 提取的精油中相对含量较高,为 55.21%。MSD 提取的精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用强于 USD 提取的精油,其对 3 种菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为 25、50、50 mg/mL。两种精油均具有较强的抗氧化活性,MSD 提取的精油对 1,1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟基自由基清除能力较强,USD 提取的精油对 2,2 - 联氮 - 二 (3 - 乙基 - 苯并噻唑 - 6 - 磺酸) 二铵盐(ABTS)阳离子自由基、超氧阴离子自由基清除能力以及对 Fe³⁺还原能力较强。两种方法提取的清香木果实精油均具有良好的抑菌和抗氧化活性,可作为抑菌剂和抗氧化剂资源进行开发利用。
关键词:清香木;精油;提取方法;化学成分;抑菌活性;抗氧化活性
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
材料:清香木成熟果实(采自云南省保山市隆阳区,洗净晾干后 - 20℃保存)。
试剂:牛肉膏、蛋白胨、琼脂条、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、DPPH、ABTS、无水乙醇等(具体来源见原文)。
1.1.2 仪器与设备
7890A-5975C 型气质联用仪(美国安捷伦)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 顶空固相微萃取头(美国 Supelco)、XM-800UVF 型智能静音超声波清洗机等(具体型号及来源见原文)。
1.2 方法
1.2.1 清香木果实精油的制备
USD 提取:称取 120 g 捣碎果实,按 1∶5 料液比加水,30℃、40 kHz、240 W 超声 30 min,水蒸气蒸馏 3 h。
MSD 提取:微波功率 480 W 处理 7 min,水蒸气蒸馏 3 h。
得率计算:精油得率 (%) = (精油质量 / 果实质量)×100。
1.2.2 清香木果实精油成分分析
SPME 条件:5 μL 精油 + 2 mL 正己烷,20℃萃取 30 min。
GC-MS 条件:HP-5MS 色谱柱,升温程序见原文;离子源 EI,扫描质量范围 20~500 amu。
1.2.3 清香木果实精油的抑菌活性测定
抑菌圈直径测定:滤纸片法,150 μL 菌悬液涂布培养基,5 μL 精油滴于滤纸片,37℃培养 24 h 后测量。
最小抑菌浓度(MIC)测定:二倍稀释法配制 3200~25 mg/mL 精油,以产生抑菌圈的最小浓度为 MIC。
1.2.4 清香木果实精油的抗氧化活性测定
DPPH 自由基清除能力:2 mL DPPH 溶液(0.2 mg/mL)+2 mL 精油,519 nm 测吸光度,计算清除率及 IC₅₀。
羟基自由基清除能力:精油 + 硫酸亚铁 + 过氧化氢 + 水杨酸,510 nm 测吸光度。
ABTS 阳离子自由基清除能力:ABTS 溶液 + 精油,734 nm 测吸光度。
超氧阴离子自由基清除能力:Tris-HCl 缓冲液 + 精油 + 邻苯三酚,299 nm 测吸光度。
Fe³⁺还原能力:精油 + 磷酸缓冲溶液 + 铁氰化钾,700 nm 测吸光度,吸光度越高还原能力越强。
2 结果与分析
2.1 两种方法提取的清香木果实精油化学成分比较
得率:USD 法 0.052%,MSD 法 0.049%,均高于水蒸气蒸馏法(0.037%)。
成分鉴定:USD 精油鉴定出 18 种化合物(相对含量 84.87%),MSD 精油鉴定出 22 种(96.83%),主要成分为萜烯类,共有成分 13 种,其中 (+)-α- 蒎烯在 USD 和 MSD 精油中相对含量分别为 55.21% 和 49.45%。
特有成分:MSD 精油含 (+)- 柠檬烯(17.52%)等 9 种特有成分,USD 精油含 (-)-β- 蒎烯(4.00%)等 5 种特有成分。
类别化合物名称相对含量(USD 精油)相对含量(MSD 精油)
萜烯类(+)-α- 蒎烯55.21%49.45%
β- 月桂烯13.95%22.29%
酯类邻苯二甲酸二乙酯-0.15%
其他十甲基环五硅氧烷0.80%0.34%
2.2 两种方法提取的清香木果实精油抑菌活性
抑菌圈直径:两种精油对 3 种菌的抑菌圈直径均为 14~20 mm(敏感),MSD 精油抑菌圈大于 USD 精油。
MIC:USD 精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的 MIC 分别为 50、50、100 mg/mL;MSD 精油分别为 25、50、50 mg/mL,抑菌效果更强。
2.3 两种方法提取的清香木果实精油的抗氧化能力
DPPH 自由基清除能力:MSD 精油清除率高于 USD 精油,40.0 mg/mL 时清除率分别为 96.30% 和 92.37%,IC₅₀分别为 6.46 和 7.32 mg/mL。
羟基自由基清除能力:96 mg/mL 时 USD 和 MSD 精油清除率分别为 94.02% 和 93.02%,IC₅₀分别为 28.45 和 27.32 mg/mL。
ABTS 阳离子自由基清除能力:USD 精油清除率高于 MSD 精油,40.0 mg/mL 时清除率分别为 96.30% 和 94.43%,IC₅₀分别为 8.32 和 10.46 mg/mL。
超氧阴离子自由基清除能力:96 mg/mL 时 USD 和 MSD 精油清除率分别为 94.63% 和 91.40%,IC₅₀分别为 32.56 和 38.72 mg/mL。
Fe³⁺还原能力:96 mg/mL 时 USD 和 MSD 精油吸光度分别为 2.013 和 2.002,USD 还原能力更强。
3 结论
提取得率与成分:USD 和 MSD 法提取的清香木果实精油得率分别为 0.052% 和 0.049%,主要成分为 (+)-α- 蒎烯,MSD 精油含更多 (+)- 柠檬烯。
抑菌活性:两种精油对 3 种菌均有较强抑制作用,MSD 精油抑菌效果更优,MIC 更低。
抗氧化活性:MSD 精油对 DPPH 和羟基自由基清除能力更强,USD 精油对 ABTS、超氧阴离子自由基清除及 Fe³⁺还原能力更强。
应用价值:清香木果实精油具有良好的抑菌和抗氧化活性,可作为天然抑菌剂和抗氧化剂开发利用。
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