骨关节炎方向优秀论文范文赏析——蛇床子素对膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　获取膝骨关节炎患者膝关节置换术中废弃的软骨组织(经患者及家属同意，通过医院伦理审查)。COL2A1、MMP13、miR-9 及 PRTG 检测试剂盒(苏州昂飞生物科技有限公司);蛇床子素(徐州医科大学药学院天然药物化学研究室)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 软骨细胞提取及培养

　　收集膝骨关节炎患者关节置换术后废弃的无菌软骨标本，置于无血清 DMEM 培养基，冰盒转移至超净台，去除多余组织，剪切成 1~3mm 碎块。用 0.25% 胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ 型胶原酶在 37℃恒温摇床中分别消化 30min 和 8h，过滤后收集滤液，1000r/min 离心 5min，弃上清，PBS 浸洗 2 遍，加入含 10% 血清 DMEM/F-12 培养液制成细胞悬液，移入培养瓶，在 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。定期观察细胞生长形态和贴壁情况，用第 3 代软骨细胞进行实验。

　　1.2.2 软骨细胞鉴定

　　形态学观察：通过倒置相差显微镜观察原代培养软骨细胞的形态学特征和生长增殖情况并照相。

　　甲苯胺蓝染色法：取第 3 代软骨细胞进行细胞爬片，贴壁后去除培养液，PBS 清洗 2 遍，4% 多聚甲醛固定 1h，1% 甲苯胺蓝染色 30min，双蒸水洗去多余染液，无水乙醇脱水，中性树胶封片，倒置相差显微镜下观察并照相。

　　1.2.3 细胞分组处理

　　取第 3 代软骨细胞，分为空白对照组和不同浓度蛇床子素处理组(0、10、50、100、150μmol/L)，用含 10% 血清的 DMEM/F-12 培养液在 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。

　　1.2.4 CCK-8 法检测细胞增殖

　　96 孔培养板中每孔接种浓度为 5×10⁴个 /mL 的软骨细胞悬液，37℃孵育 4~6h，各组设 6 个复孔。细胞贴壁后加入不同浓度蛇床子素，孵育 24h，每孔加 10μL CCK-8 试剂，酶标仪 450nm 波长处检测光密度(OD)值估计细胞活力。

　　1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

　　收集处理后的第 3 代软骨细胞，用碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素偶联的 AnnexinV 染色，流式细胞仪检测凋亡并绘制散点图统计凋亡率。

　　1.2.6 qRT-PCR 检测

　　对数生长期细胞采用 Trizol 法提取总 RNA，用 PrimeScript RT reagent Kit 逆转录为 cDNA。以 U6 作为内参，用 ABI7500 实时定量 PCR 仪进行实验，Opticon Monitor3 软件分析结果。引物序列如下：

　　目的基因引物序列

　　U65'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3';5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'

　　miR-95'-GGAGTCCGTGTGTCTGTGTG-3';5'-GCTTTATGACGGCTCTGTGG-3'

　　COL2A15'-GACGCCACGCTCAGTC-3';5'-TCTCCGCTCTTCCACTCTG-3'

　　MMP135'-TGGGCCTTCTGGTCTTC-3';5'-GTTGTAGCCTTTGGAGATG-3'

　　PRTG5'-CGAAGCAAAGCCAGGAAGTC-3';5'-GCTTGTTGTGAATCCCTGAGCG-3'

　　Caspase-35'-AAGCGAATCAATGGACTCTGG-3'

　　1.2.7 Western Blot 法检测

　　对数生长期软骨细胞加蛋白裂解液提取总蛋白，Bradford 法定量。总蛋白(50μg)经 12% SDS-PAGE 电泳后转移至 PVDF 膜，与抗 COL2A1、MMP

　　13、miR-9、PRTG、Caspase-3 及 β-actin 单克隆抗体 4℃孵育过夜。PBST 洗膜 3 次(每次 5min)，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育 2h，洗膜后用鲁米诺试剂和过氧化氢溶液(1∶1)显色，扫描拍照分析，以目标条带与内参照条带灰度值之比作为蛋白质相对表达水平。

　　1.3 统计学方法

　　采用 SPSS20.0 统计软件，计量资料以 x±s 表示，组间比较用单因素方差分析，方差不齐时采用布朗 - 福赛斯和韦尔奇方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 软骨细胞形态学观察

　　软骨细胞多呈多边形，甲苯胺蓝染色后细胞核为蓝色。0、10、50、100μmol/L 蛇床子素处理后的软骨细胞形态无明显改变。CCK-8 实验显示，蛇床子素浓度超过 100μmol/L 时细胞活力显著下降，≤100μmol/L 时对软骨细胞无毒，其中 100μmol/L 蛇床子素的保护作用最强。

　　2.2 软骨细胞凋亡情况

　　空白对照组软骨细胞凋亡率为 14.60%±1.21%，0、10、50μmol/L 蛇床子素处理组凋亡率(13.25%±1.32%)无明显变化;100μmol/L 蛇床子素处理组凋亡率降至 5.67%±1.43%，与对照组及低浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05);150μmol/L 组凋亡率为 10.31%±1.16%，与 100μmol/L 组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明 100μmol/L 蛇床子素抑制软骨细胞凋亡作用最强。

　　2.3 qRT-PCR 检测结果

　　空白对照组及 0、10、50、150μmol/L 蛇床子素处理组中，miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG 及 Caspase-3 的 mRNA 表达无明显变化;100μmol/L 蛇床子素处理组中，miR-9 和 COL2A1 表达上调，MMP13、PRTG 及 Caspase-3 表达下调，与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示蛇床子素可能通过上调 miR-9 抑制 PRTG 表达，调节 p53/Caspase-3 通路，抑制软骨细胞凋亡和基质降解。

　　2.4 Western Blot 法检测结果

　　0、10、50、150μmol/L 蛇床子素处理组中，miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG 及 Caspase-3 的蛋白表达无明显变化;100μmol/L 蛇床子素处理组中，miR-9 和 COL2A1 蛋白表达上调，MMP13、PRTG 及 Caspase-3 蛋白表达下调，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，进一步证实 100μmol/L 蛇床子素可抑制软骨细胞凋亡和基质降解。

　　3 讨论

　　膝骨关节炎(KOA)以膝关节疼痛、畸形及功能障碍为特征，蛇床子素(OST)具有抗氧化、止痛等作用，可能通过调控软骨细胞增殖与凋亡缓解软骨退变。本研究显示，100μmol/L 蛇床子素可显著减少膝骨关节炎软骨细胞凋亡，上调 miR-9 和 COL2A1 表达，下调 MMP13、PRTG 及 Caspase-3 表达(P<0.05)。

　　机制上，miR-9 在 KOA 患者中表达降低，可通过靶向 PRTG 基因调节软骨细胞活性;PRTG 过表达会激活 p53/Caspase-3 通路促进软骨细胞凋亡。蛇床子素可能通过上调 miR-9 抑制 PRTG 和 Caspase-3，阻断软骨细胞凋亡及基质降解，从而保护关节软骨，缓解骨关节炎进展。

　　本研究存在局限性，如软骨细胞来源单一，后续需通过不同供体样本及基因敲除动物模型进一步验证结论。

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