从国际联盟 MiBioGen 的 GWAS 数据集中选择与人类肠道微生物组组成相关的 SNPs 作为 IV。GWAS 数据集中包含了来自美国等 18 340 名参与者的 16S 核糖体 RNA 基因测序图谱和基因分型数据，共有 211 个分类群符合微生物数量性状基因座定位分析的条件。为控制种群结构异质性对因果效应推断有效性的潜在影响，本研究在孟德尔随机化分析中限定遗传 IV 来源于欧洲群体。在本研究中，属是最低的分类级别。该研究获得宁夏医科大学伦理委员会的批准(编号：宁医大伦理第 2022-N035 号)。 11.1.2 结局数据

　　对于 CVDs 数据集，扩张型心肌病、冠心病、高血压病和深静脉血栓四类疾病分别代表心肌病变、动脉粥样硬化、血流动力学异常、凝血功能障碍。从全基因组关联研究 GWAS 数据库中(GWAS ID：finn-b-FG_CVDs)获得了 CVDs 数据，汇总高血压(GWAS ID：ukb-b-14177)、扩张型心肌病(GWAS ID：ebi-a-GCST90018834)、冠心病(GWAS ID：ebi-a-GCST000998)、血栓(GWAS ID：ukb-a-65)数据。病例组与对照组的结局数据分布情况见表 1。 231.2 IV 选择

　　为了确保 GM 与 CVDs 之间因果关系结论的真实性和准确性，使用以下质量控制步骤来选择最佳 IV：1)选择与 GM 显著相关，显著性阈值(P<1×10⁻⁹)SNP 作为 IV;2)需确保所包含的 IV 之间不存在连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)。目前的研究通过结块过程(clump_r2 =0.01，clump_kb=5 000)评估 SNPs 之间的 LD;3)确保 SNPs 对暴露的影响与对结果的影响对应于相同的等位基因，删除回文 SNPs(例如 A/T 或 G/C 等位基因);4)使用 PhenoScanner 数据库中在 R²>0.80 的阈值上删除与混杂因素和 CVDs 结局相关的 SNP。用公式 F=beta²/se² 计算 F 统计量;排除 F<10 的 SNP，得到可靠的 SNP 作为 IV。

　　41.3 数据分析

　　数据分析使用 R 4.2.1 软件中 TwoSampleMR 包。通过 IV 估计风险因素对复杂疾病的因果影响。用 5 种方法进行孟德尔随机化分析：以 IVW 为主要方法和研究依据，以孟德尔随机化、加权中位数、Simple mode 和加权众数为辅助方法。以 P<5×10⁻⁶为标准提取 IV。通过留一法检验结果的水平多效性。由于人群和 SNPs 的差异，孟德尔随机化分析的异质性检验中 F<10 被认为无弱 IV 偏倚。 52 结果

　　以属为筛选标准，共筛选出 7 个属，77 个符合条件的 SNPs。真杆菌 4 种：瘤胃真杆菌、短真杆菌、裂链真杆菌和产粪固醇真杆菌。瘤胃球菌属 1 种：扭链瘤胃球菌。结果表明，以扩张性心肌病为结局，真杆菌菌属中共有 17 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=1.326，95% CI=1.072～1.639，P=0.009)。以高血压为结局，短真杆菌属中共 8 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.984～0.999，P=0.030)。以深静脉血栓为结局，瘤胃真杆菌属共 15 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=1.003，95% CI=1～1.005，P=0.02)。以冠心病为结局，在瘤胃真杆菌属共 8 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=1.155，95% CI=1.007～1.325，P=0.039)。其中另一种扭链瘤胃球菌共 8 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.986-0.999，P=0.031)。以 CVDs 为结局，裂链真杆菌属共有 8 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=1.058，95% CI=1.002～1.116，P=0.041)。在产粪固醇真杆菌属中共 14 个 SNPs 可作为 IV，IVW(OR=1.09，95% CI=1.002～1.184，P=0.044)，见表 2。 67

　　以扩张型心肌病为结局，在 R²>0.80 阈值上通过 PhenoScanner 去除与混杂因素相关的 9 个 SNPs 和与结局相关的及回文 SNPs，共提取 157 个 SNP，真杆菌菌属共 17 个 SNPs 可作为 IV。以高血压为结局，共提取 158 个 SNP。短真杆菌属共 8 个 SNPs 可作为 IV。深静脉血栓疾病为结局，删除 9 个 SNPs 相关及回文 SNPs，提取 157 个 SNP。扭链瘤胃球菌属共 9 个 SNPs 作为 IV。瘤胃真杆菌属共 15 个 SNPs 可作为 IV。以冠心病为结局，共提取 157 个 SNP。瘤胃真杆菌属共 8 个 SNPs 可作为 IV。另一种扭链瘤胃球菌属中共 8 个 SNPs 可作为 IV。以 CVDs 为结局，删除相关及回文 SNPs 共提取 157 个 SNPs。裂链真杆菌属共 8 个 SNPs 可作为 Ⅳ。产粪固醇真杆菌共有 14 个 SNPs 可作为 Ⅳ，见图 1。 8

　　GM 和 CVDs 的森林图可看出，产粪固醇真杆菌与 CVDs 风险呈正相关(P<0.05)，为危险因素;瘤胃真杆菌与冠心病呈正相关(P<0.05)，为危险因素。埃尔格尼斯氏芽孢杆菌可降低扩张型心肌病风险(P<0.05)，短真杆菌是高血压的保护因素(P<0.05)。瘤胃球菌是深静脉血栓的保护因素(P<0.05)，见图 2。 93 讨论

　　本研究结果表明不同的 GM 对 CVDs 具有不同的影响。GM 可以从 3 种不同的机制来影响 CVDs 的发展：GM 可以通过影响各种免疫细胞来激活免疫系统从而加速 CVDs 的形成 [8];GM 产生的 TAMO 物质通过激活血小板活性促进 CVDs 的形成 [9];在膳食中物质通过代谢途径和免疫反应影响动脉粥样硬化的发生和发展，因此探究其具体 GM 种类分别对 CVDs 的机制很有必要 [10-11]。真杆菌属指一组由革兰氏阳性、均匀或多形的不形成孢子的、明显厌氧的和化能有机营养的细菌杆状体组成的细菌 [12]。有实验表明在肥胖患者和高脂饮食小鼠模型中均发现真杆菌属的减少与动脉粥样硬化病变的发展呈负相关关系 [13-14]。在本研究中，真杆菌属对于 CVDs 是双刃剑，对扩张型心肌病等属于危险因素;在综合的 CVDs 数据集中又是保护因素。研究中真杆菌属的遗传预测丰度升高与扩张性心肌病和冠心病风险呈正相关，提示真杆菌属参与两类 CVDs 的病理进程。既往研究也强调代谢功能的宿主保护作用 [15]。另有研究表明在 TMAO 通路上，真杆菌属的部分菌种可将膳食胆碱氧化为 TMAO [16]。另一方面，真杆菌属参与肠道初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化，与扩张性心肌病的病理特征吻合。最后，从炎症与免疫调节角度来说，真杆菌属的脂多糖结构诱导全身炎症进而加重血管内皮损伤和心肌纤维化 [17]。此外，瘤胃球菌属的遗传预测丰度升高与冠心病和深静脉血栓风险呈负相关 [18]。 11121315

　　综上所述，GM 和 CVDs 之间具有因果关系，改善 GM 可能对预防和治疗 CVDs 有一定的临床意义。然而本研究亦存在局限性，由于在分析中使用汇总统计量而非原始数据，无法进行亚组分析以探索是否存在非线性关系。为了进行敏感性分析和水平多效性检验，有必要将更多的遗传变异作为工具变量。 164 结论

　　GM 和 CVDs 之间具有因果关系，改善 GM 可能对预防和治疗 CVDs 有一定的临床意义。 18附：表格与图表说明

　　表 1 病例组与对照组的结局数据分布情况

　　结局n病例组对照组SNPs 数量

　　CVDs456 468101 866116 926116 926

　　高血压111 14812 171450 8399 851 867

　　扩张型心肌病355 3811 444353 93719 080 278

　　冠心病86 99522 23364 7622 415 020

　　深静脉血栓337 1596 767330 39210 894 59610

　　表 2 肠道微生物与 CVDs 因果关系

　　结局GM (暴露)方法nβSEP 值

　　CVDs裂链真杆菌MR-egger80.1410.1390.348

　　Weighted median80.0610.0360.089

　　IVW80.0560.0280.041

　　simple mode80.0720.0560.238

　　Weighted mode80.0720.0510.204

　　产粪固醇真杆菌MR-egger140.5540.1640.006

　　Weighted median140.1580.0590.007

　　IVW140.0850.0420.044

　　simple mode140.1930.1130.113

　　扩张型心肌病瘤胃真杆菌MR-egger170.3090.4030.455

　　Weighted median170.2190.1520.149

　　IVW170.2820.1080.009

　　simple mode170.2030.2780.476

　　Weighted mode170.2030.2850.486

　　高血压病短真杆菌MR-egger8-0.0270.0130.091

　　Weighted median8-0.0080.0040.079

　　IVW8-0.0080.0040.030

　　冠心病瘤胃真杆菌simple mode8-0.0060.0070.431

　　Weighted mode8-0.0060.0060.356

　　MR-egger8-0.0960.2560.721

　　Weighted median80.1840.0900.041

　　IVW80.1440.0700.039

　　扭链瘤胃球菌simple mode80.1850.1410.230

　　Weighted mode80.1890.1360.207

　　MR-egger8-0.3050.2430.256

　　Weighted median8-0.2230.1360.101

　　IVW8-0.2140.0990.031

　　simple mode8-0.2130.1990.320

　　Weighted mode8-0.2410.1770.214

　　深静脉血栓扭链瘤胃球菌MR-egger9-0.0060.0090.533

　　Weighted median9-0.0070.0030.034

　　IVW9-0.0080.0030.018

　　simple mode9-0.0060.0050.280

　　Weighted mode9-0.0060.0040.191

　　瘤胃真杆菌MR-egger150.0020.0040.678

　　Weighted median150.0030.0010.037

　　IVW150.0030.0010.029

　　simple mode150.0030.0030.226

　　Weighted mode150.0030.0020.19414

　　图 1 GM 与 CVDs 因果关系的散点图(原文图 1 对应内容)

　　通过散点图展示不同菌属与各类 CVDs 的关联强度，如埃尔格尼斯氏芽孢杆菌与扩张型心肌病、瘤胃真杆菌与冠心病等的相关性分布。 17图 2 与心血管类疾病有因果关系的肠道微生物森林图(原文图 2 对应内容)

　　以森林图形式呈现各菌属作为危险因素或保护因素的 OR 值及置信区间，例如产粪固醇真杆菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184)为 CVDs 危险因素，短真杆菌(OR=0.992，

　　1. 研究目的

　　使用孟德尔随机化研究方法验证肠道微生物群(GM)与心血管疾病(CVDs)之间的因果关系1。

　　2. 数据来源

　　暴露数据：来自 MiBioGen 联盟的 GWAS 数据集，包含 18340 名参与者的 16S 核糖体 RNA 基因测序图谱和基因分型数据，筛选与 GM 相关的 SNPs 作为工具变量，限定遗传 IV 来源于欧洲群体，以 “属” 为最低分类级别2。

　　结局数据：从 GWAS 数据库中获得 CVDs 数据，包括扩张型心肌病、高血压、冠心病、深静脉血栓，具体病例组与对照组分布见表 13。

　　3. 研究方法

　　IV 选择：选择与 GM 显著相关(P<1×10⁻⁹)、无连锁不平衡、非回文且与混杂因素及结局无关的 SNPs，计算 F 统计量并排除 F<10 的弱工具变量4。

　　数据分析：使用 R 软件 TwoSampleMR 包，采用 IVW、加权中位数、Simple mode、加权众数、MR-Egger 等方法进行孟德尔随机化分析，以 P<5×10⁻⁶提取 IV，通过留一法检验水平多效性5。

　　4. 主要结果

　　扩张型心肌病：瘤胃真杆菌(OR=1.326，95% CI=1.072~1.639，P=0.009)可能增加其风险6。

　　高血压：短真杆菌(OR=0.992，95% CI=0.984~0.999，P=0.030)有保护作用6。

　　深静脉血栓：扭链瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.018)有保护作用，瘤胃真杆菌(OR=1.003，95% CI=1~1.005，P=0.029)增加其风险7。

　　冠心病：瘤胃真杆菌(OR=1.155，95% CI=1.007~1.325，P=0.039)增加其风险，扭链瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.031)有保护作用7。

　　总体 CVDs：裂链真杆菌(OR=1.058，95% CI=1.002~1.116，P=0.041)和产粪固醇真杆菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184，P=0.044)可能增加其风险7。

　　5. 讨论

　　作用机制：GM 可通过激活免疫系统、产生 TMAO 激活血小板、影响膳食代谢与免疫反应等机制影响 CVDs 发展8。

　　研究意义：证实 GM 与 CVDs 存在因果关系，为通过调节 GM 预防和治疗 CVDs 提供依据9。

　　局限性：使用汇总统计量而非原始数据，无法进行亚组分析及探索非线性关系，需更多遗传变异作为工具变量9。